川芎为伞形科植物川芎的照应钻研干燥根茎，性味辛温，面法归肝、优化氧化胆、川芎心包经，卵白具活血行气、工艺祛风止痛的及抗成果。首载于《神农本草经》，活性为驰名的照应钻研川产道地药材。当初对于川芎所含成份的面法钻研，主要会集于小份子成份，优化氧化对于川芎大份子成份的川芎钻研甚少。前期钻研开始表明，卵白川芎中含有丰硕的工艺卵白质，且具备较好的及抗抗氧化能耐。做作卵白质因其源头丰硕、可生物降解、情景友好性以及高生物活性等特色，近些年来成为做作抗氧化剂的钻研热门。

氧逍遥基对于生物大份子、氨基酸、DNA、脂类以及卵白质等组成氧化伤害且与癌症、动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病、神经功能拦阻以及免疫零星削弱等慢性疾病的爆发无关。经钻研发现，植物源卵白质具备抗凝血、抗肿瘤、抗氧化以及抗真菌等生物活性，如石斛卵白提取液、葛根卵白、豌豆卵白、黑豆卵白等均具备较好的抗氧化活性，对于羟基逍遥基以及DPPH逍遥基有精采的翦灭下场，大豆卵白具备较强的DPPH逍遥基翦灭能耐。当初，川芎卵白（LCP）抗氧化能耐的相关钻研未见报道，本钻研旨在经由Box-Behnken照应面法判断其最佳提取条件；以DPPH逍遥基翦灭、羟逍遥基翦灭以及超氧阴离子逍遥基翦灭率为目的，以抗坏血酸为阴性比力妨碍合成，审核LCP的抗氧化活性，同时为LCP的开拓提供坚贞的数据质料。

1 质料与措施

1.1 质料与仪器

川芎，贵阳济仁堂药业有限公司；BCA卵白浓度测定试剂盒、考马斯亮蓝R250、十二烷基硫酸钠、Maker、抗坏血酸尺度品（VC）北京索莱宝科技有限公司；DPPH逍遥基翦灭能耐试剂盒、羟逍遥基翦灭能耐试剂盒、超氧阴离子翦灭能耐试剂盒　苏州格锐思生物科技有限公司。

PHS-3CpH计，上海仪电迷信仪器股份有限公司；TU-1810紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；AL204电子天平，美国梅特勒托利多公司；FD冷冻干燥机，上海拓纷机械配置装备部署有限公司；MultiskanFC酶标仪，赛默飞（上海）世尔仪器有限公司。

1.2 试验措施

1.2.1 卵白浓度测定

分说罗致5mg/mL的尺度溶液四、六、八、十、十二、1四、1六、1八、20μL于96孔板中，并用蒸馏水补足至20μL。分说退出200μLBCA使命液（BCA试剂与铜试液50:1）混匀，室温静置l0min，于650nm下检测差距浓度牛血清卵白溶液的吸光值A，以卵白品质浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制尺度曲线，回归方程为：y=2.2706x+0.0402（R2=0.9993）。川芎提取物中LCP浓度凭证上述回归方程求患上。

1.2.2 单因素试验

基于前期钻研，以LCP患上率为检测目的，分说以pH、提取光阴、料液比为影响因素以妄想单因素试验。

1.2.2.1 川芎药材前处置

取干燥清洁的川芎药材，破碎捣毁，过3号筛（50目）。称取过多过筛后的川芎药材粉末置于圆底烧瓶中，加4倍量沸程为30～60℃煤油醚水浴回流脱脂1h，静置后过滤，将川芎药材粉末于透风橱做作晾干，备用。

1.2.2.2 LCP的提取

详尽称取川芎药材粉末3g，平行三份，退出Tris-HCl（68妹妹ol/L，0.5%SDS，5%甘油，10%β-巯基乙醇）溶液，置于4℃冰箱浸提1.5h。5000r/min离心10min，群集上清，退出3倍量10%TCA-丙酮，置−20℃冰箱积淀1.5h，5000r/min离心10min，群集积淀，分说用丙酮及80%丙酮洗涤3次，5000r/min离心10min，群集积淀，冷冻干燥即患上LCP，按公式（1）合计患上率。

式中：M₁展现川芎卵白冻干粉的品质，g；M₂展现川芎药材的品质，g。

1.2.2.3 差距pH对于LCP患上率的影响

按“1.2.2.2”项下操作，牢靠提取光阴为1.5h，料液比为1:15g/mL，钻研提取液pH（三、四、五、六、七、八、9）对于LCP患上率的影响。

1.2.2.3 差距pH对于LCP患上率的影响

按“1.2.2.2”项下操作，牢靠提取光阴为1.5h，料液比为1:15g/mL，钻研提取液pH（三、四、五、六、七、八、9）对于LCP患上率的影响。

1.2.2.4 料液比对于LCP患上率的影响

按“1.2.2.2”项下操作，牢靠提取光阴为1.5h，提取液pH为6，钻研料液比（1:十、1:1五、1:20、1:2五、1:30g/mL）对于LCP患上率的影响。

1.2.2.5 提取光阴对于LCP患上率的影响

按“1.2.2.2”项下操作，牢靠料液比为1:20g/mL，提取液pH为6，钻研提取光阴（0.五、一、1.五、二、2.5h）对于LCP患上率的影响。

1.2.3 LCP提取条件的照应面试验妄想

为抉择最佳试验条件，以A（提取光阴h）、B（料液比g/mL）、C（提取溶剂pH）为自力变量，卵白患上率为照应变量，接管DesignExport8.0.6的Box-Behnken照应面措施（RSM）优化历程。各组平行3次，因素以及水平见表1。

1.2.4 SDS-PAGE凝胶电泳

接管贺小燕等试验措施，以4.5%的稀释胶以及12.5%的分说凝胶妨碍SDS-PAGE电泳，稀释胶电压80V电泳20min，分说胶电泳120V电泳80min，调拨剂抵达分说胶底部约1cm处停止电泳，考马斯亮蓝R250染色，脱色液脱色至条带清晰。

1.2.5 LCP等电点测定

取10支清洁离心管，称重。凭证表2，分说退出差距体积LCP溶液（50mg/mL），再分说退出差距浓度、差距体积的乙酸溶液或者去离子水，混合，测定pH。于4℃静置1h后，5000r/min离心15min。残缺作废上清液后，将带有积淀物的离心管称重，经由减重法合计积淀品质。由于卵白质在pI处积淀至多，即可测定川芎的pI。

1.2.6 LCP消融度的测定

将50mg样品悬浮在10mL蒸馏水中，并运用1mol/mL的HCl或者NaOH溶液将悬浮液的pH调节至2～12。将悬浮液在22℃下不断搅拌1h，并在5000r/min离心15min，BCA试剂盒测定上清液中卵白质的量。消融度按公式（2）合计。

式中：M₁：悬浮液中退出的卵白总量，mg，M₂：离心后上清液卵白的量，mg。

1.2.7 LCP抗氧化能耐的测定

1.2.7.1 羟逍遥基翦灭能耐的测定

取差距浓度的LCP溶液各0.125mL，按试剂盒退出反映试剂一、试剂二、试剂三各0.125mL以及0.5mL的蒸馏水，混匀，即为测定组。取等体积蒸馏水，依法制备空缺组。取差距浓度的LCP溶液液各0.125mL，退出反映试剂一、试剂二各0.125mL以及0.625mL的蒸馏水，混匀，即为比力组。于37℃反映20min，转移至玻璃比色皿中，蒸馏水调零，510nm读取各组吸光度值A，平行测定3次，以VC为阴性比力组，公式（3）合计翦灭率。

式中：A₁：空缺组吸光度值，A₂：测定组吸光度值，A₃：比力组吸光度值。

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